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紫外分光光度計法測定不同產地瓜馥木中黃酮含量

黃酮類化合物是瓜馥木中主要活性成分之一 ,筆者通過建立不同產地瓜馥木中總黃酮的紫外分光光度計測定方法,以期為瓜馥木藥材的質量控制 ,中藥瓜馥木的用藥安全性控制提供依據。
1  材料與方法

1.1  材料

1.1.1 研究對象。瓜馥木 , 2005年采自廣西臨桂 ,由廣西師范大學生命科學院唐紹清教授鑒定為瓜馥木 [ Fisistigm aoldhami(Hemsl.)Mer.]。

1.1.2 主要試劑。蘆丁對照品(批號:080 -9303),中國藥品生物制品檢定所提供;其他試劑均為市售分析純。 1.1.3 主要設備：UV1901PC紫外可見分光光度計、超聲波清洗機、 旋轉蒸發儀;電子天平,。

1.2  方法

1.2.1 對照品溶液制備。精密稱取蘆丁對照品適量(約 10 mg),置于 25.0 ml容量瓶中,加入體積分數為 70%的乙醇超聲溶解并稀釋至刻度,搖勻 ,即得對照品溶液。
1.2.2 供試品溶液的制備。精密稱取瓜馥木藥材約 1.0 g, 置于 250.0 ml圓底燒瓶中,加入 100.0 ml體積分數為 70%
乙醇,加熱回流 2 h,放冷 ,補重 ,過濾 ,精密吸取濾液 3.0 ml, 蒸干,殘渣加約 2.0 ml水溶解,通過聚酰胺色譜柱, 依次用水、50%乙醇、90%乙醇洗脫至無色 ,合并 50%乙醇和 90%乙醇洗脫液,蒸干,備用。

1.2.3  顯色條件的考察。

1.2.3.1 加熱時間的考察 。精密吸取藥材溶液 5份,每份 2.0 ml,置于加有鎂粉 250 mg的具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不時振搖試管,后加入70%乙醇至 7.0 ml,搖勻 ,置于沸水浴中分別加熱 20、40、60、80、100 min,取出,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補足至 7.0 ml,搖勻,依次測定吸光度。

1.2.3.2 鎂粉用量的考察。精密吸取藥材溶液 5份,每份 2.0 ml,分別置于加有不同量鎂粉的具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不時振搖試管;后加 70%乙醇至 7.0 ml,搖勻,置沸水浴中加熱 1 h,取出,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補足 7.0 ml,搖勻,依次測定吸光度值。

1.2.4.1 測定波長的確定。分別精密吸取蘆丁對照品溶液 1.0 ml和供試品溶液 2.0 ml,置于加有 250 mg鎂粉的具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不斷振搖試管,后滴加入 70%乙醇至 7.0 ml,振搖均勻,放置沸水浴中加熱 1 h,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補足至 7.0 ml,搖勻,在 400 ～ 800 nm范圍內測定紫外吸收光譜,確定測定波長。 1.2.4.2 線性關系考察。精密吸取蘆丁對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml,分別置于加有鎂粉 250 mg的

具塞刻度試管中,置于冷水浴中,逐漸滴加濃 HCl3.0 ml,并不時振搖試管,后加 70%乙醇補足至 7.0 ml,搖勻,置沸水浴中加熱 1 h,取出 ,迅速冷卻至室溫后再加入 70%乙醇補足至 7.0 ml,搖勻,于測定波長處測定吸光度值。以蘆丁對照品濃度(X)為橫坐標,吸光度 (Y)為縱坐標,計算回歸方程。 1.2.4.3 穩定性試驗 。精密吸取蘆丁對照品溶液 1.0 ml和供試品溶液 2.0 ml,顯色后 ,分別在第 0、15、30、45、60 min測定吸光度值。計算相對標準偏差值(RSD)。

1.2.4.4 精密度試驗。精密吸取供試品溶液 3.0 ml,置于加有鎂粉 250 mg的具塞刻度試管中,按 “1.2.4.1”中方法測定吸光度值 ,連續測定 6次,計算 RSD值。

1.2.4.5 重復性試驗 。精密稱取同一批瓜馥木藥材 6份,每份約 25 mg,分別置于 50.0 ml容量瓶中 ,加入 70%乙醇超聲溶解,定容至刻度,搖勻 ,備用。精密吸取 3.0 ml溶液 ,按“1.2.4.1”中方法測定吸光度值,計算 RSD值。

1.2.4.6 加樣回收率試驗。取同一批瓜馥木藥材 6份,每份約 5 mg,分別置于 10.0 ml容量瓶中,按照“1.2.2”中方法制備樣品溶液,分別精密加入濃度為 0.434 8 mg/ml的蘆丁對照品溶液 0.1 ml,再加入 70%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取 2.0 ml樣品測定,計算平均回收率及 RSD值。

1.2.5 不同產地瓜馥木黃酮含量測定。精密稱取 3批瓜馥木藥材粉末各約 1.0 g,分別置于 250.0 ml圓底燒瓶中,按“1.2.2”中方法制成供試品溶液 ,按“1.2.4.1”中方法測定吸光度值,計算黃酮含量。

2  結果與分析

2.1  顯色條件考察結果

2.1.1 加熱時間的考察 。加熱時間對吸光度值的影響可知 ,加熱 60 min時吸光度大,故顯色時間選擇 60 min。

2.1.2 鎂粉用量的考察。結果表明,鎂粉用量為 250 mg時吸光度大,故鎂粉用量選擇 250 mg。
2.2  方法學考察結果

2.2.1 測定波長的確定 。蘆丁對照品和待測樣品顯色前后的吸收紫外光譜可知,對照品和樣品均在 516 nm處有大吸收,故確定 516 nm為測定波長。

2.2.2 線性關系考察結果。計算得回歸方程為 Y=7.490 9X -0.025 6(r=0.9991),表明在0.0056 ～ 0.1120mg/ml范圍2.2.3 穩定性。蘆丁對照品和藥材溶液顯色后 60 min內基本穩定,計算得 RSD值為 1.12%和 1.28%(n=5)。

2.2.4 精密度。計算得 RSD值為 0.45%,表明試驗精密度良好。

2.2.5 重復性。計算 RSD值為 0.28%,表明該方法重復性良好。

2.2.6  回收率。回收率測得結果見表 1。由表 1可知,平均回收率為 99.76%, RSD值為 2.85%。

2.3  不同產地瓜馥木黃酮含量測定結果 不同產地瓜馥木黃酮含量測定見表 2。由表 2可知,產地 7 的瓜馥木中黃酮含量高,為 0.833%。

3  結論與討論

(1)在考察顯色方法的過程中,筆者曾采用 NaNO2-Al(NO3 )3-NaOH比色法 ,但該方法樣品大吸收波長與對照品大吸收波長相差較大,而且用該反應測定黃酮類化合物專屬性較差 ,終采用鹽酸鎂粉比色法作為瓜馥木總黃酮含量測定方法。

(2)考察顯色條件時,由于藥材中雜質較多,成分比較復雜 ,該研究對藥材提取物,采用聚酰胺樹脂進行了初步的純化,以便獲得較好的峰形。

(3)采用紫外分光光度法測定了 9個不同產地瓜馥木中
總黃酮的含量,除了 6、8和 9 號 3個產地的含量略微低于0.8%,其他產地的總黃酮含量基本穩定。測定結果的 RSD值均符合要求,說明該方法準確、穩定、可行。